蛋白表达|认识质粒

发布时间：2023-04-24

一、 蛋白表达|认识质粒

在做蛋白体外表达，我们首先要把需要表达的基因构建到载体上，然后通过在导入到宿主细胞进行表达。那么如何看懂质粒图谱成为入门蛋白体外表达载体重要步骤。以Pet-28a为例子，介绍载体各元件的作用。

图1 pET-28a载体图谱

复制起点(ori)：控制着质粒的复制，并决定了质粒的宿主属性和拷贝数；Ori对于复制的控制，可分为松弛型和严谨型。松弛型质粒在细菌内的复制不受控制，拷贝数＞10个拷贝，严谨型质粒＜10个拷贝。常见的Ori如ColE1和pBR322等，属于松弛型。若图谱上带有两个复制子，是为了增强载体在细菌中的复制效率或提高负载能力。这种设计可以使得载体在宿主细胞中更快地复制，并在细胞系列中更稳定地维持。

Rop: RNA随机分解元件。rop基因编码一种称为RNA随机分解蛋白（RNase）

它的主要功能是调节质粒中RNA的稳定性。这个蛋白负责降解过量的RNA，确保在质粒复制过程中RNA的水平保持适当的平衡。通过控制RNA的降解，rop有助于维持质粒的稳定性，防止过多的RNA积累影响到质粒的功能和复制。

Lac I: 编码Lac 阻遏物

图2 操纵子Lac I抑制蛋白表达原理图

当内源性乳糖水平较低时，lac阻遏物（由lacI表达）能够与lacO序列结合，并抑制T7启动子介导的目的基因转录。如果存在乳糖（更准确地说，一种称为异乳糖的代谢物） 或其类似物IPTG，则这些物质会与lac阻遏物结合并改变其构象。这可以阻止lac阻遏物与lacO结合，从而实现操纵子的去阻遏表达。转录后的mRNA上指导核糖体的结合。核糖体结合到RBS上，使得它能够正确地起始翻译并合成蛋白质。

MGS：多克隆位点，需要表达的基因在这个位置选择合适的酶切位点插入到载体中。

RBS:核糖体结合位点。

转录后的mRNA上指导核糖体的结合。核糖体结合到RBS上，使得它能够正确地起始翻译并合成蛋白质。因此，对于构建表达载体时，需要注意观察核糖体结合位点的位置，防止插入后基因移码突变，导致无法表达目的蛋白。

筛选标记：多为抗性基因，以便加以检测筛选；图中的抗性为卡那霉素；

 表1 常用原核抗性