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学海拾遗

文献分享|提高原核表达系统中难表达蛋白质可溶性表达的策略综述

发布时间:2024-04-18

江南大学许正宏教授和史劲松教授团队在《Metabolic Engineering》期刊上发表综述,探讨了通过蛋白质工程和合成生物学策略提高原核表达系统中难表达蛋白质(DEPs)可溶性表达的最新进展。文章简要概述了影响蛋白质正确折叠的关键因素和折叠机制,总结了提升DEPs可溶性表达的蛋白质工程先进技术和工具、蛋白质质量控制系统、原核表达系统的再设计以及无细胞表达技术的进展。

合理设计蛋白序列



QTY code 技术

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图1 QTY code 技术流程

张曙光教授团队开发的QTY code 技术是利用QTY电子密度的相似性,用Q、T和Y分别用来代替L、I或V和F,从而得到溶解度高的CCR5(QTY)



基于噬菌体辅助定向进化技术

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     图2 PACE系统工作流程  

研究人员还开发出一套基于噬菌体辅助定向进化技术来筛选。在PACE系统中,大肠杆菌宿主细胞培养液持续流入(constant inflow),含有噬菌体的宿主细胞培养液被持续抽走(constant outflow)。

在这过程中噬菌体会感染大肠杆菌,将自身基因组注入宿主细胞内后进行装配增殖。如上图所示,细菌中有三个组件,分别是AP、MP、SP。

其中SP是选择性噬菌体,其含有一段目的蛋白POI和有缺陷的gIII基因。gIII基因可编码pIII蛋白,组成噬菌体的尾部,介导噬菌体和大肠杆菌结合。如果噬菌体无法诱导pIII蛋白,则噬菌体失去侵染大肠杆菌的能力,从而不会被系统抽走。

AP是一个质粒,其含有gIII基因,可以弥补SP上缺乏的gIII基因,然而AP启动转录需要POI蛋白的介导才能启动,因此,如果AP的转录无法启动,则噬菌体无法侵染大肠杆菌。而MP也是一个质粒,其编码了若干增加DNA突变概率的基因,并含有阿拉伯糖启动子。通过加入阿拉伯糖诱导增加DNA突变概率的基因的表达,从而引起POI蛋白出现不同类型的突变。而只有与AP的启动子结合的POI蛋白,才能侵染大肠杆菌,从而不会被该系统所筛选。




基于计算生物学和生物物理学设计

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图 3 PROSS和EnzymeMiner的工作流程

Barber-Zucker基于序列别对和Rosetta 建模预测中的 ΔΔGcalc 来计算位置特异性替换矩阵 (PSSM),以找到表现出更高表达和稳定性的突变的最佳组合。同时,Hon通过溶解度设计算法,优先考虑更有可能在大肠杆菌中保留催化活性和可溶形式的序列。

融合可溶性标签



用于可溶性表达的常见伴侣蛋白或标签

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图4 常见伴侣蛋白和标签

目的蛋白表达过程中常会遇到包涵体的问题,包涵体是不溶性的蛋白质颗粒,形成原因比较复杂,可能是由于蛋白生成过快,没有充足的时间进行折叠,也可能是因为在原核表达系统中缺少翻译后修饰,无法完成目的蛋白的正确合成。针对这种包涵体蛋白,可与辅助折叠的伴侣蛋白或者增加可溶性的标签蛋白进行共表达,从而提高复杂蛋白表的可溶性。

优化转录和翻译元件



优化密码子

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图5 稀有密码子停止翻译机理

mRNA在体内翻译的过程中,需要tRNA携带的氨基酸作为原料合成对应的多肽。然后,如果对应的tRNA是稀有密码子,这会导致核糖体在翻译过程中等待时间过长,从而被认为是蛋白的终止翻译,因此无法翻译成对应的蛋白质。因此,可以利用密码子的简并性,选取肥西有密码子替代稀有密码子,从而优化其蛋白的表达。



基于核糖体改造提高翻译

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图6 oRibo-PACE 工作流程

刘教授通过开发了一种有趣的核糖体定向进化系统 oRibo-PACE,以扩大大肠杆菌、铜绿假单胞菌和霍乱弧菌的翻译动力学潜力。与最先进的正交翻译系统相比,oRibo-PACE 的蛋白质产量提高了 6.3 倍,ncAA 的掺入效率提高了 9 倍。

优化蛋白质的折叠



降低毒蛋白的生理干扰

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图7  Ssr A 降解错误折叠蛋白机制

SsrA 是一种由 9-11 个氨基酸组成的降解决定子,可被接头蛋白 SspB 特异性识别,在某些情况下,它与 ClpX 合作并与 SsrA 标记的蛋白紧密结合,导致底物的蛋白水解(Flynn 等人,2001)。雷等人设计了一个特定的 SspB-SsrA-ClpXP 系统,具有更高的降解效率和 SspB-ssrA 对降解决定子 SsrA 的结合特异性,该系统提高了阿魏酸的产量,并通过工程化的 SsrA 标记的 S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶原(SpeD)显示出对细胞生理活性的最小干扰。

选择合适的宿主菌



选取合适的宿主菌

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图 8 表达宿主特征与优势

不同的宿主菌其基因型是不一样的。有些经过特殊修饰的载体,或者特殊用途的载体,或者有特殊启动子的载体,必须选择合适的宿主菌进行表达。因此,当你的蛋白没有表达出来时,可以考虑更换宿主菌。通过找到合适的宿主菌,可以为蛋白的表达提供合适的环境,从而成功表达蛋白。


无细胞表达(CFE)技术



运用无细胞表达技术

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图9 无细胞表达流程

基于细胞的重组蛋白表达有时受到异源蛋白对宿主的毒性及其被蛋白酶降解的限制,CFE技术可以用作替代技术来克服活细胞表达系统的无效性。从广泛的宿主模式生物中制备具有转录能力和翻译能力的提取物,包括从天然σ因子中激活内源性转录。文章总结了无细胞表达技术中制备提取物的方案及其在膜蛋白和单克隆抗体蛋白生产中的应用。

SPRING  FESTIVAL

SPRING  FESTIVAL

上述综述近期正式在《Metabolic Engineering》期刊上发表,题为“Improving the soluble expression of difficult-to-express proteins in prokaryotic expression system via protein engineering and synthetic biology strategies”,硕士研究生陈金平为论文第一作者,龚劲松教授为通讯作者。

论文链接:https://doi.org/10.1016/j.ymben.2023.05.007