蛋白表达|枯草芽孢杆菌表达系统

枯草芽孢杆菌表达系统

       枯草芽孢杆菌表达系统是一种常用于生产外源蛋白的原核表达系统，它具有非致病性、分泌蛋白能力强等特点，是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主。

       相比大肠杆菌表达系统，枯草芽孢杆菌表达系统具有更高的蛋白产量、更好的生物活性，同时内毒素含量较低，蛋白可溶性好。此外，枯草芽孢杆菌能够适应低温培养条件，适用于工业酶等蛋白的生产。

       相比大肠杆菌表达系统，枯草芽孢杆菌表达系统具有更高的蛋白产量、更好的生物活性，同时内毒素含量较低，蛋白可溶性好。此外，枯草芽孢杆菌能够适应低温培养条件，适用于工业酶等蛋白的生产。

基因克隆  

        首先要对外源基因片段进行密码子优化，确保其在枯草芽孢杆菌中能够高效表达。随后，将优化后的基因片段连接到合适的表达载体上。

表达载体的选择与转化

        选择合适的表达载体对于蛋白的表达至关重要。常用的载体包括pHT系列载体，如pHT01和pHT43，它们能够在枯草芽孢杆菌中实现高效表达。转化过程可通过电击法、化学法等方式进行，目的是让携带外源基因的载体进入枯草芽孢杆菌细胞内。

培养与表达

        将转化后的阳性克隆株进行培养，在适宜条件下表达目标蛋白质。表达过程中，可以通过优化培养基配方、调节培养条件来提高目标蛋白的表达水平。通常在培养至OD600=0.8-1.0时，添加IPTG诱导剂进行表达。

1.块状沉淀：这是枯草芽孢杆菌在发酵后期可能会产生的物质，属于正常现象

2.转化效率：枯草芽孢杆菌的转化效率相对比较低，推荐使用高转化率的感受态或者采用电击法进行转换。

3.胞内外蛋白分析：

（1）针对胞内表达，可以直接使用超声波破碎细胞后分析；

（2）针对胞外分泌表达，可以使用TCA方法或相关标签树脂进行纯化分析

常用菌种：

菌株168：适用于胞内表达。枯草芽孢杆菌168菌株具有强大的分泌蛋白质的能力，相比于大肠杆菌，枯草芽孢杆菌的细胞壁组成更为简单，不含类似革兰氏阴性菌细胞壁成分中的热源性脂多糖（内毒素），能高效表达hFGF21、几丁质酶、阿洛酮糖异构酶、低聚半乳糖苷酶、甘露聚糖酶等9个异源蛋白质。[1]

菌株AS1：它可以作为胞内和胞外表达的通用菌。由于AS1菌株没有明显的密码子偏爱性，因此在表达外源蛋白时无需对DNA序列进行优化。

菌株WB800N：枯草芽孢杆菌自然拥有高效的蛋白分泌系统，能够将目的蛋白直接分泌到胞外。而且WB800N菌株是一株胞外蛋白酶缺陷的菌株，这意味着它不会像其他枯草芽孢杆菌那样降解表达的外源蛋白，从而提高了蛋白表达产物的稳定性。

常见载体：

pHT01：pHT01是一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的表达载体，可以在枯草芽孢杆菌中高效表达重组外源蛋白。

pHT254：pHT254是一种枯草芽孢杆菌诱导型表达载体，具有pgrac100启动子，其启动活性是普通pgrac启动子的8倍。

pHT43：pHT43是一种枯草芽孢杆菌表达载体，它的特点是通过IPTG诱导，能够高水平分泌表达目的蛋白。编码α-淀粉酶的amyQ基因的信号肽编码区域与pHT01的SD序列融合，构成了pHT43，以此获得分泌的重组蛋白。

pTD161：这是一个带有淀粉酶信号肽的分泌表达载体，可以用于外源蛋白的分泌表达。

pTD162：这是一个表面展示载体，可以用于外源蛋白与胞衣蛋白cotG的融合表达。

pBE2：pBE2是是天津大学赵学明教授提供的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒，它可以同时在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中复制，并在枯草芽孢杆菌中表达外源蛋白。

pSA60：pSA60是一个含有枯草芽孢杆菌sacB基因的启动子信号肽序列的质粒。这种类型的质粒载体是由枯草芽孢杆菌隐性质粒与大肠杆菌质粒构成的穿梭载体。

pETAM：pETAM是一种适用于枯草芽孢杆菌的表达载体，它可以用来表达各种外源基因。例如，可以通过将地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因进行耐酸性改造，并利用获得的sacB基因的启动子-信号肽序列（称为sacR）构建诱导型分泌表达载体，并实现了在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。

[1]An operator-based expression toolkit for Bacillus subtilis enables fine-tuning of gene expression and biosynthetic pathway regulation